Aislamiento de microorganismos a partir de tejido vegetal

Actualización: 26 julio 2010

Basado en Alvarez 2000 (Plant Disease. 84 (4):423), Alvarez 2003 (Plant Disease. 87 (11):1322) y Arnold 2007

DESINFECCIÓN DE TEJIDOS

Materiales:
200 ml hipoclorito de sódio al 1%
100 ml alcohol 95%
1 L agua estéril
Toallas de papel estéril
3 beakers de 100 ml
Pinzas y bisturí

Realizar todo el procedimiento con material estéril y en condiciones de asepsia, utilizar cabina de flujo laminar.

Procedimiento:
1 Cortar el tejido a esterilizar, utilizar pinzas y bisturí en todos los pasos
2 Limpiar el tejido con agua para quitar el exceso de polvo
3 Secar con una toalla de papel
4 Colocar el tejido a esterilizar en un beaker de 100 ml
5 Adicionar alcohol al 95% por 10 segundos, parar el proceso descartando directamente el alcohol, ayudarse con las pinzas para no perder los tejidos
5 Adicionar hipoclorito de sódio al 1% por 1 min., parar el proceso descartando directamente el hipoclorito, ayudarse con las pinzas para no perder los tejidos.
6 Adicionar agua estéril para lavar los tejidos por 30 segundos. Parar el proceso descartando directamente el agua, ayudarse con las pinzas para no perder los tejidos.
7 Repetir el lavado dos veces más
8 Colocar los trozos de tejidos en toallas de papel estéril para remover el exceso de agua

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DIRECTAMENTE DEL TEJIDO

Esta metodología es conveniente cuando el microorganismo de interés crece de forma rápida. Para aislar microorganismos de crecimiento lento usar el método de diluciones seriadas.

Materiales:
Pinzas y bisturí
Placas con agar zanahoria (sin antibiotico para aislar bacterias o con antibiotico para aislar hongos)

Procedimiento:
Realizar todo el procedimiento con material estéril y en condiciones de asepsia, utilizar cabina de flujo laminar.

1 Sobre la toalla de papel estéril cortar los bordes del tejido estéril para remover el tejido dañado por el hipoclorito.
2 Colocar los trozos de tejido sobre agar zanahoria, cuatro trozos de tejido por cada caja de petrí. Colocar los trozos en agar sin antibiótico para aislar bacterias y sobre agar suplementado con 0,1mg/ml de carbenicilina y ampicilina para aislar hongos.
3 almacenar las placas con la tapa hacia arriba para que no se caiga el tejido del agar, asegurarse de que las cajas no se abran (meter en una bolsa, o colocar teipe de electricidad)
4 Incubar a 27°C, monitorear diariamente en la mañana
5 Cuando se observe crecimiento del hongo sobre el agar, transferir una pequeña porción de micelio a un agar nuevo en tubo. Transferir los micelios que morfológicamente se vean diferentes. Incubar a 27°C por tres semanas.
6 hacer cultivos monosporicos

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS POR DILUCIONES SERIADAS

Con esta metodología se pueden aislar microorganismos que se encuentran en abundancia en el tejido vegetal pero que tienen un crecimiento lento, por lo que es difícil de aislar usando la metodología de tejido sobre agar. En la última metodología los microorganismos de crecimiento rápido no permiten el crecimiento de los de crecimiento lento, aunque haya mayoría de estos en comparación con los microorganismos de crecimiento rápido.

Materiales:
200 ml tween 20 0,05%
Microtubos de 1,5 ml
Micro mango
Pipeta de 20 – 200 microlitros
Pipeta de 200 – 1000 microlitros
Puntas para pipetas de 2 a 200 y de 200 a 1000 microlitros
Cucharilla de metal
Pinzas y bisturí

Procedimiento:
Realizar todo el procedimiento con material estéril y en condiciones de asepsia, utilizar cabina de flujo laminar.
1 colocar cada tejido estéril de aproximadamente 5 mm2 en micro tubos de 1,5ml
2 Adicionar 500 microlitros de tween 20 0,05%
3 macerar el tejido con un micro mango
4 Del macerado hacer diluciones seriadas de 1/10, 1/100, 1/1.000, 1/10.000 y 1/100.000 con un volumen final de 0,5 ml en tween 20 0,5%
5 Adicionar 50 microlitros de cada dilución a placas con agar zanahoria y esparcir de forma homogénea. Hacer dos placas para la última dilución. Usar placas sin antibiótico para aislar bacterias y con 0,1mg/ml de carbenicilina y ampicilina para aislar hongos
6 almacenar las placas con la tapa hacia arriba por las primeras 24 horas, después colocar las placas boja abajo, asegurarse de que las cajas no se abran (meter en una bolsa, o colocar teipe de electricidad)
4 Incubar a 27°C, monitorear diariamente en la mañana
5 Cuando se observe crecimiento del hongo sobre el agar, transferir una pequeña porción de micelio a un agar nuevo en tubo. Transferir los micelios que morfológicamente se vean diferentes. Incubar a 27°C por tres semanas.
6 hacer cultivos monosporicos a los micelios provenientes de mezclas de micelios, especialmente los crecidos en las diluciones 1/10, 1/100 y 1/1.000

ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CRECIMIENTO

NOTA IMPORTANTE:
Durante el proceso de autoclave el medio esta a 150ºC, por lo que si la botella se llena, la botella puede explotar. Por lo tanto para autoclavar usar sólo 2/3 del volumen total del frasco. Es decir, si el frasco es de 500ml llenarlo solo hasta 300 ml.

3) Autoclavar a 121ºC, 15 psi por 20 minutos

4) Deje el agar sobre el mesón para que se atempere. Usted puede acelerar el proceso de enfriamiento colocando el frasco bajo el agua fría, con mucho cuidado ya que el frio brusco hara que se formen burbujas que puede aumentar la presión del frasco, por lo que hay que liberar el gas cuidadosamente y manteniendo la esterilidad.

5) Una vez que el medio esta homogéneamente a 70ºC aproximadamente (Usted puede tocar la botella sin ser quemado) adicione el antibiótico a una concentración final de 100 μg/ml de penicilina y 50 μg/ml de kanamicina

6) Prenda la campana de flujo laminar media hora antes de servir el medio. Limpie la campana con alcohol al 70% y sirva el medio con la ayuda de un mechero.

7) Deje solidificar las placas con la tapa abierta, posteriormente tapelas y almacenelas dentro de la bolsa en que venían las placas.

8) Deje las placas a temperatura ambiente si las va a usar el mismo día, de lo contrario llevelas a 5ºC una vez que estén completamente frías para evitar que se condense el vapor el tapa de la placa.

AUTOCLAVE

AUTOCLAVE

1) colocar la manguera de la tapa dentro del canal del soporte interno

2) Cerrar usando las manijas contrarias y tener cuidado de que la distancia entre la tapa y la olla sea igual en toda la circunferencia

3) Prender el autoclave y colocar la manilla de control al máximo

4) Sí el autoclave esta frío, dejar 30 minutos para que la presión llegue a 5 psi

5) Abra la válvula de escape (subir la válvula) hasta que salga todo el aire

6) Baje la válvula de escape

7) Revise que la presión llegue a 15 psi, aproximadamente 15 minutos

8) Cuando la presión este en 15 psi, coloque el control de la temperatura en el No. 2 y contabilice 20 minutos para medio y material y 40 minutos para material contaminado. La presión se debe mantener entre 15 y 17 psi, aumente la temperatura si baja de 15psi y baje la temperatura si pasa de 17psi. La flecha no debe pasar a la zona verde ni roja

8) Una vez finalizado el tiempo, apague el autoclave y desenchufela

9) Cuando la presión baje a 5 psi, abra la válvula de escape y abra la olla.

medio de crecimiento

Agar zanahoria

Reactivos para un litro:
100g de zanahoria
15 g de agar
agua destilada o desionizada

Procedimiento:
1) pesar 100 g de zanahoria, cortarla en trozos y adicionarla a la licuadora
adicionar 200 ml de agua destilada a la licuadora y licuar hasta que la zanahoria quede bien partículada

2) pasar la solución a un frasco tapa azul, lavar la licuadora con agua destilada y completar el volumen del frasco tapa azul.

Medio sintético:

Basado en Tendler 1961(para el aislamiento de actinomicetos termofilos)

sacarosa 1%

NaNO3 0,2%

K2HPO4 0,1%

MgSO4.7H2O 0,05%

KCL 0,05%

FeSO4.7H2O 1mg /100 ml

microelementos 0,1ml /100 ml

Microelementos

por ml:

ZnSO4 1,0 mg

MnSO4 0,5 mg

CuS04 0,08 mg

CoS04 0,1mg

H3BO3 0,1 mg